分光光度計的應(yīng)用常識

        分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗室的常規(guī)儀器。常用于核酸、蛋白質(zhì)定量和細(xì)菌生長濃度的定量。
        分光光度計的簡單原理
        分光光度計使用可產(chǎn)生多種波長的光源，通過一系列分光裝置，產(chǎn)生特定波長的光源。光源通過被測樣品后，部分光源被吸收，計算出樣品的吸光度值，從而轉(zhuǎn)化為樣品的濃度。樣品的吸光度與樣品的濃度成正比。
        核酸定量
        核酸定量是分光光度計Zui常用的功能。它可以量化溶解在緩沖液中的寡核苷酸、單鏈、雙鏈 DNA 和 RNA。核酸最高吸收峰的吸收波長為260nm。每種核酸的分子組成不同，因此其換算系數(shù)也不同。要對不同類型的核酸進(jìn)行定量，必須事先選擇相應(yīng)的系數(shù)。例如1OD的吸光度相當(dāng)于50μg/ml dsDNA、37μg/ml ssDNA、40μg/ml RNA和30μg/ml Olig。將試驗后的吸光度值按上述系數(shù)換算得到相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原溶液和稀釋劑的體積，然后測試空白溶液和樣品溶液。然而，實驗并非一帆風(fēng)順。不穩(wěn)定的讀數(shù)可能是實驗者最頭疼的問題。儀器的靈敏度越高，吸光度的變化就越大。
        實際上，分光光度計的設(shè)計原理和工作原理是允許吸光度值在一定范圍內(nèi)變化的，即儀器具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。例如，Eppendorf Biophotometer 的準(zhǔn)確度≤1.0% (1A)。此類多次測試的結(jié)果在平均值約 1.0% 之間波動是正常的。此外，還應(yīng)考慮核酸本身的理化性質(zhì)以及溶解核酸的緩沖溶液的pH值和離子濃度。測試過程中，離子濃度過高，也會造成讀數(shù)漂移。因此，建議使用一定的pH值和低離子濃度。緩沖器，例如 TE，可以地穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度也是一個不可忽視的因素：樣品中難免會有一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在會干擾測試效果。為了盡量減少顆粒對檢測結(jié)果的影響，要求核酸吸光度值至少大于0.1A，吸光度值優(yōu)選為0.1～1.5A。在此范圍內(nèi)，粒子干擾較小，結(jié)果穩(wěn)定。
        所以表示樣品的濃度不能太低或太高（超出光度計的測試范圍）。最后是操作系數(shù)，如果混合充分，否則吸光度值太低，甚至為負(fù)；混合溶液不能有氣泡，空白溶液不能有懸浮物，否則讀數(shù)會急劇漂移；測試空白溶液和樣品必須使用同一個比色皿，否則濃度差異過大；換算系數(shù)與樣品濃度單位選擇相同；不能使用帶有磨損窗口的比色皿；樣品體積必須達(dá)到比色皿和許多其他操作所需的最小體積。
        除了核酸濃度，分光光度計還顯示幾個非常重要的比率來表示樣品的純度，例如A 260 / A 280的比率，用于評價樣品的純度，因為吸收峰蛋白質(zhì)的波長為 280nm。對于純樣品，該比率大于 1.8 (DNA) 或 2.0 (RNA)。如果比值低于1.8或2.0，則表明受到蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的影響。 A 230 表示樣品中含有糖類、肽類、酚類等污染物。相對純核酸的A 260/A 230 比值大于2.0。 A 320 檢測溶液的濁度和其他干擾因素。對于純樣品，A 320 一般為零。
        蛋白質(zhì)的直接定量（UV 法）
        這種方法是在280nm波長直接檢測蛋白質(zhì)。選擇Warburg公式，光度計可直接顯示樣品濃度，或選擇相應(yīng)的換算方法將吸光度值換算成樣品濃度。
        蛋白質(zhì)測定過程很簡單，先測空白溶液，再直接測蛋白質(zhì)。因為buffer中有一些雜質(zhì)，一般需要去掉320nm的“背景"信息，將此功能設(shè)置為“on"。與待測核酸類似，要求A 280的吸光度值至少大于0.1A，最佳線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移"。這是正常現(xiàn)象。事實上，只要A 280 的吸光度值的變化范圍不超過1%，就說明結(jié)果非常穩(wěn)定。
        漂移的原因是因為Warburg公式的吸光度值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光度值變化一點，濃度就會被放大，使得結(jié)果很不穩(wěn)定。
        直接蛋白質(zhì)定量方法適用于檢測純度較高且成分相對單一的蛋白質(zhì)。與比色法相比，UV直接定量法速度更快，操作簡單；但易受平行物質(zhì)干擾，如DNA；此外，靈敏度低，需要更高濃度的蛋白質(zhì)。